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 【摘要】

移植的多巴胺能 (DA) 祖細胞的存活和突觸整合對于改善帕金森病 (PD) 的運動癥狀至關重要。然而，人類多能干細胞 (hPSC) 衍生的 DA 祖細胞在植入之前和植入過程中會受到許多壓力因素的影響，從而導致存活率低。此外，與胎兒組織移植物相比，hPSC 衍生的移植物顯示出較差的可塑性。這些觀察結果表明，更有利的宿主環境可能會改善移植結果。

最近，澳大利亞國立大學David R. Nisbet教授、墨爾本大學Clare L. Parish教授團隊對DA祖細胞移植物的組織特異性支持提供了一個完全表征的自組裝肽水凝膠。這種仿生水凝膠基質經過編程以支持 DA 祖細胞：i) 在基質中包含層粘連蛋白表位；ii) 剪切包裹膠質細胞系衍生神經營養因子 (GDNF) 以確保其持續遞送。生物相容性水凝膠使 A9 神經元規格（對運動功能至關重要的 DA 神經元亞群）增加了 51%。GDNF 的持續遞送誘導 DA 神經元增加 2.7 倍并增強移植物可塑性，導致 6 個月時運動缺陷的顯著改善。這些發現強調了逐步定制組織特異性水凝膠的治療益處，以改善人 PSC 衍生神經移植的物理和營養支持，從而提高 PD 移植物的標準化、可預測性和功能功效。相關論文以題為Tissue Programmed Hydrogels Functionalized with GDNF Improve Human Neural Grafts in Parkinson's Disease發表在《Advanced Functional Materials》上。

【圖文解析】

自組裝肽水凝膠制造

如前所述，自組裝肽 (SAP) 是使用固相肽合成制造的。創建并篩選了五種肽，以確定支持人類 PSC 衍生的 VM 祖細胞的最佳水凝膠序列。肽序列，如圖 1A 所示: 包括：i）苯丙氨酸-苯丙氨酸（FF），ii）異亮氨酸-賴氨酸-纈氨酸-丙氨酸-纈氨酸（IKVAV），iii）賴氨酸-異亮氨酸-纈氨酸-丙氨酸-纈氨酸（KIVAV），iv）亮氨酸-精氨酸-亮氨酸-纈氨酸-亮氨酸 (LRLVL) 和 v) 酪氨酸-異亮氨酸-甘氨酸-絲氨酸-精氨酸 (YIGSR)。

圖1 SAP水凝膠生物材料的生成。

鑒定支持移植神經祖細胞存活和調節局部炎癥的最佳 SAP 水凝膠

接著，團隊評估了每種 SAP 水凝膠支持人類 PSC 衍生的 VM 神經祖細胞移植物存活的能力-替換在帕金森病中逐漸退化的多巴胺神經元所需的細胞群。祖細胞是使用已建立的無異種方案從 LMX1A-eGFP 人類多能干細胞分化而來的。在分化的第 11 天 (D11)，通過底板標記物 FOXA2、前腦-中腦轉錄因子 OTX2 和神經祖細胞標記物 NESTIN 的共表達驗證了培養細胞的適當和有效的 VM 命運規范-在 >85%的細胞中共表達 細胞（圖 2A、B）。在移植時 (19 DIV)，77.5% 的細胞表達早期內在多巴胺決定簇轉基因 LIM 同源框轉錄因子 1α（LMX1A-eGFP ；圖 2C）。如前所述，為了在移植物中富集 VMDA 神經元，可以通過 FACS（圖 2D）輕松分離該群體。

圖2 hPSC 衍生的 VM 祖細胞的分化，適用于共植入和篩選基于肽的 SAP 水凝膠。

組織特異性支架提供功能性 GDNF 以促進體外 DA 存活和可塑性

團隊評估了 IKVAV SAP 水凝膠在延長的時間范圍內維持 GDNF 遞送的能力，并在體外影響嚙齒動物和人類 VM 祖細胞的行為。重要的是，具有 GDNF 的 SAP 水凝膠的剪切封裝對凝膠的組裝或機械性能沒有影響（圖 3A-D）。使用 SAXS 進一步檢查 IKVAV 水凝膠和負載有 GDNF 的水凝膠的結構。X 射線散射剖面顯示 IKVAV SAP (凝膠) 和 GDNF 加載的 SAP (凝膠 GDNF) (圖 3E) 之間沒有顯著差異。

圖3 從 IKVAV SAP 水凝膠遞送 GDNF 并確認維持的功能活性。

GDNF 功能化支架促進帕金森病大鼠的功能恢復和移植物存活率

隨后測試了 GDNF 剪切封裝的 IKVAV SAP 水凝膠是否能夠支持 hPSC 衍生的 VM 祖細胞移植物在帕金森病大鼠腦中的長期結構和功能整合（圖 4A）。在 6OHDA 損傷（移植前，Pre-Tx）后 4 周對單側 6OHDA 損傷大鼠的不對稱運動功能障礙進行行為測試，并在移植后 24 周重復（圖 4B）。所有動物在移植前都表現出旋轉不對稱（> 6 轉 min-1），這種缺陷僅在未移植動物（僅病變）中持續存在 24 周（圖 4C）。在用于評估自發運動功能的圓柱體任務中，移植前的所有動物都顯示出對側前爪使用的缺陷（與未受損的同側爪相比，受損對側的使用 ≈10%）。只有在 GDNF 功能化 SAP 支架（細胞 SAP-shGDNF；黑色條）存在的情況下接受移植的動物在移植后 24 周顯示出肢體使用的顯著改善（圖 4D）。

圖4 將人 ESC 衍生的 VM 祖細胞與 GDNF 功能化的組織特異性支架一起植入可改善帕金森病大鼠的運動功能。

功能化支架促進 DA 神經元的存活和偏置 A9 規范

神經元核 (NeuN ) 和 HNA 的共免疫反應性表明，無論是否存在水凝膠或 GDNF 蛋白，所有移植物中約有三分之一的細胞采用成熟的神經元表型（圖 5A-C）。這些神經移植物影響運動功能的必要條件是它們形成成熟的、表達 TH 的 DA 神經元的能力。正如先前報道的 LMX1A-GFP 分離的祖移植物，總移植物的 ≈7% 表達了共表達的 TH（TH /HNA ）。雖然 GDNF（細胞 sGDNF）的急性遞送或 IKVAV SAP 水凝膠（細胞 SAP）的存在對 TH 細胞數量沒有影響，但在 SAP 支架存在下進行移植，維持 GDNF 遞送（細胞 SAP-shGDNF） ，顯示 TH 細胞增加了 2.7 倍（圖 5D-H）。移植物中 DA 神經元的這種增加超過了移植物體積的增加，TH 細胞密度顯著升高（圖 5I)。

圖5 功能化支架可增加移植物尺寸、DA 神經元產量和偏置 A9 規范。

參考文獻：

doi.org/10.1002/adfm.202105301