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基于此，華中科技大學同濟醫學院協和醫院骨科劉國輝教授、米博斌和荷蘭格羅寧根大學Mohammad-Ali Shahbazi教授綜述了近年來利用功能性水凝膠制備和再生技術改變DFUs免疫微環境的研究進展。本文簡要介紹了DFUs的病理特征和愈合過程，并總結了設計用于DFUs免疫調節的再生水凝膠所必需的理化性質。然后，討論了水凝膠的潛在免疫治療模式，以及通過多種治療方法和增強療效和安全性來治療DFUs的新趨勢。綜上所述，通過將水凝膠的結構特性與其在DFU治療中的功能聯系起來，特別是在免疫調節刺激方面，這篇綜述將推動設計用于DFU的先進水凝膠的進一步進展，并在不久的將來轉化為臨床應用，從而改善糖尿病創面的修復。相關綜述以“Immunomodulatory Hydrogels: Advanced Regenerative Tools for Diabetic Foot Ulcer”發表在《Advanced Functional Materials》。

圖1. 組織修復和再生過程中的動態免疫細胞串擾

DFUs的病理特點及愈合過程

皮膚免疫微環境包括分布在表皮和真皮層的固有和適應性免疫細胞，它們與組織細胞(如成纖維細胞、角質形成細胞和血管內皮細胞)相互作用，以維持免疫穩態并促進組織再生(圖1)。新證據表明免疫細胞和免疫微環境在創面修復和再生中發揮重要作用。經典的傷口愈合階段包括止血、炎癥、增殖和重塑，每個階段都涉及免疫調節。DFUs通常涉及免疫功能障礙，表現為病理條件下巨噬細胞表型轉換失敗。與DFUs相關的病理生理現象包括持續過度的炎癥反應、異常的免疫微環境、多重感染、血管生成受損和再上皮化延遲由于多種細胞因子的作用，DFUs不能進入增殖期。促進糖尿病創面由炎癥期向增殖期過渡是加速創面愈合的潛在策略。因此，改變加速這一轉變的信號通路可能成為通過免疫和非免疫方法促進組織再生的治療靶點。

在過去的幾十年里，生物活性材料作為一種有希望的策略，通過解決與DFUs治療相關的巨大挑戰來消除轉化差距。尤其在DFUs的臨床前研究中，水凝膠被廣泛用于促進組織再生和作為藥物遞送的功能載體。我們前期研究表明，多功能水凝膠可負載并持續釋放活性小分子或細胞外囊泡來調節糖尿病創面局部免疫微環境，尤其是介導巨噬細胞的表型極化和重編程，進一步調節血管內皮細胞或成纖維細胞的功能，最終顯著促進糖尿病創面的愈合。如圖2所示，目前應用于組織再生的水凝膠體系包括水凝膠體系、水凝膠-細胞體系、水凝膠-分子體系、水凝膠外泌體體系以及復合體系。與其他生物材料相比，水凝膠在體內毒性和環境毒性方面具有突出的優勢，使功能性水凝膠受到廣泛歡迎，在組織修復和再生方面具有重要價值。

圖2. 水凝膠療法應用于組織修復和再生的四個經典階段

DFUs免疫調節功能水凝膠的必要性質

在各種天然材料中，脫細胞ECM是一種交聯生物活性蛋白的混合物，能夠引導細胞遷移、增殖和分化，并表現出免疫調節特性。最近，Vriend等人進行的一項研究表明，通過免疫反應和基質重塑觀察到，豬皮來源的ECM水凝膠未能導致更好的真皮傷口愈合。結果表明，ECM的成分似乎過于復雜，ECM水凝膠的應用可能會誘導免疫細胞的促炎和促愈合表型。HAs是ECM的主要糖胺聚糖，已被廣泛用于開發DFUs水凝膠，并被報道在調節巨噬細胞活化和重編程中發揮作用。低分子量HA (5 kDa)促進了M1型極化，表現為促炎基因的表達增強，如NOS2, TNF, IL12b和CD80，以及促炎細胞因子的分泌增加，如一氧化氮(NO)和TNF-α。另一方面，高分子量HA (3000 kDa)誘導了M2型極化，這通過上調抗炎基因，包括ARG1, IL10和MRC1得到證實。鑒于高分子量HA對免疫細胞行為的調節作用，其已被廣泛用于制備用于慢性創面免疫調節的功能性水凝膠。例如，Liu等開發了一種Cu2+/高分子量HA/PVA水凝膠來調節M2表型巨噬細胞，從而改善創面床的免疫微環境。該水凝膠能夠將M1型巨噬細胞極化為M2型巨噬細胞，并保持創面處M2型巨噬細胞的一致表型，是一種有效的DFUs治療策略。在最近的一項研究中，Xu等人用苯硼酸(PBA)修飾HA甲基丙烯酸酯(HAMA)，并制備了一種對葡萄糖有反應的HAMA-PBA/兒茶素(HMPC)水凝膠，用于治療糖尿病創面。HMPC水凝膠表現出優越的葡萄糖響應性兒茶素釋放行為，并能有效清除活性氧(ROS)。開發的HMPC水凝膠還能夠促進血管生成，減少炎癥反應(如IL-6水平降低和IL-10水平升高所示)，導致體內糖尿病傷口快速愈合(圖3A)。此外，Qin等制備了一種ha -明膠(HA-GEL)水凝膠來模擬ECM，并證明該水凝膠通過促進細胞存活、黏附和增殖以及降低創面床中炎癥趨化因子水平來改善糖尿病小鼠的傷口愈合。蠶絲纖維蛋白(Silk fibrin, SF)是一種天然的氨基酸聚合物，是開發用于DFUs的功能性水凝膠的另一種有前景的生物材料。核因子κ b (NF-κB)信號通路參與了SF誘導的創面愈合。近年來，SF的免疫調節功能逐漸被揭示。Chouhan等人利用從家蠶(Bombyx mori)和柞蠶(Antheraea assama)分離的SF溶液共混開發了原位形成的SF水凝膠，由于β-片層結構的形成，SF溶液表現出固有的自組裝和交聯。與膠原凝膠相比，SF水凝膠更有利于成纖維細胞增殖和角質形成細胞遷移。此外，SF水凝膠通過促進從炎癥階段向增殖階段的轉變，從而加速傷口愈合，這一點得到了TNF-α和CD163表達下調的證實(圖3B)。

圖3. 基于水凝膠化學的免疫調節

此外，水凝膠的孔隙率和孔徑已被證明可以調節免疫反應。高孔隙率或較大孔徑的水凝膠有利于免疫細胞的浸潤。已經證明巨噬細胞極化也與支架的孔隙率和孔徑大小相關。例如，Li et al.制備了不同孔徑的3D打印聚己內酯/PEG/羥基磷灰石(PCL/PEG/HA)支架(209.9±77.1µm, 385.5±28.6µm, 582.1±27.2µm)，并報道孔徑較大的支架顯著降低異物反應，促進M2巨噬細胞浸潤(圖4)。Chen等在體外和體內研究了聚2-羥乙基甲基丙烯酸酯(pHEMA)和聚二甲基硅氧烷(PDMS)支架的孔徑對DC成熟和募集的影響。他們證實，與孔徑較大(90µm)的支架相比，孔徑較小(20µm)的支架更有利于DC活化和富集，無論使用何種聚合物。然而，水凝膠的孔隙率和孔徑如何影響炎癥反應尚不清楚。水凝膠的孔隙率和孔徑大小調節免疫細胞活性的潛在機制的詳細研究是必要的。同時觀察水凝膠的形貌以調節巨噬細胞的反應。Singh等人進行了一項研究，他們研究了水凝膠的微圖紋表面對巨噬細胞活化的影響。他們證明，在微溝/脊和微柱上培養的巨噬細胞表達與初級代謝過程相關的不同基因譜。但未觀察到明顯的M1或M2表型極化。此外，其他水凝膠表面性質，如粗糙度和親水性，對免疫細胞行為的影響也需要進一步研究。

圖4. 高孔隙率或大孔徑的水凝膠有利于免疫細胞的浸潤

功能性水凝膠免疫調節的潛在治療方式

許多文獻表明，由各種生物活性物質構成的水凝膠具有多種作用，包括免疫調節，對抗多種疾病的發展。由于免疫反應在不同疾病進展過程中產生的作用不同，水凝膠的治療效果可分為促進或抑制免疫系統的作用。眾所周知，由失調的免疫反應引起的持續感染和新生血管失敗與DFUs的發病機制密切相關，而水凝膠發揮促愈合作用的一個關鍵機制與改善免疫穩態失衡有關。由陽離子型殼聚糖/陰離子型葡聚糖和彈性蛋白基水凝膠組成的雜化水凝膠在傷口部位募集巨噬細胞和中性粒細胞，有利于清除入侵的病原體和壞死組織(圖5A,B)。樹突狀水凝膠和海藻酸鈉水凝膠分別減弱IL-1β和NO的生成，促進巨噬細胞M2表型極化，從而改善局部炎癥反應，從而增強角質形成細胞、成纖維細胞和內皮細胞(ECs)的存活。此外，據報道，某些類型的水凝膠可以通過增加M2巨噬細胞的聚集，在皮膚再生過程中觸發血管生成啟動并抑制瘢痕形成。因此，通過調節不同階段的免疫微環境，這些水凝膠在促進DFUs愈合方面顯示出積極的作用。其他疾病如骨和軟骨缺損、脊髓和神經損傷、結腸潰瘍、心包內粘連、牙髓和骨骼肌損傷也在水凝膠的免疫調節作用下呈現緩解趨勢。

圖5. 水凝膠在炎癥緩解和組織再生中的免疫調節作用

此外，越來越多的臨床前證據表明，水凝膠載體是細胞治療的關鍵遞送策略。移植的細胞被包裹在多孔的微粒中，克服了細胞存活率低和在宿主生態位中保留率低的缺點。由于具有自我更新能力和多種生物學功能，特別是通過控制免疫細胞的生長、遷移、分化和成熟而發揮強大的免疫介導作用，來自骨髓、臍帶、脂肪和神經組織的干細胞是用于再生的水凝膠的主要群體。皮下注射巰基化透明質酸水凝膠攜帶脂肪間充質干細胞，抑制IL-13、趨化因子配體11 (CCL11)和CCL24的表達，可見目標區域的表皮厚度和肥大細胞通透性減弱，特應性皮炎得到改善(圖6A、B)。

圖6. 水凝膠負載干細胞對免疫應答的調節作用

此外，許多研究表明越來越多的生物活性因子依賴于其高效的免疫調節功能來治療疾病和改善健康，如白細胞介素、趨化因子、植物化學物質、miRNA、金屬離子、氣體分子、單克隆抗體、細菌成分、細胞溶解物、集落刺激因子、黏附分子、他汀類藥物、降糖藥物和免疫抑制劑。由于某些分子自身的缺點，如在水中溶解不良、突然釋放、無引導的分散和快速降解，與水凝膠相關的遞送方法在很大程度上抵消了這些缺點，如溶解度、穩定性和生物利用度的增加。臨床前數據揭示，從水凝膠中釋放的生物活性物質主要通過介導巨噬細胞表型轉換和細胞因子分泌來拮抗炎癥反應，從而抑制DFUs的發展。當巨噬細胞群中CD206、Arg-1、IL-10和轉化生長因子β (TGF-β)表達升高，CD86、iNOS、IL-1β和TNF-α表達降低時，負載在水凝膠中的芍藥苷通過影響STAT1/6的活性，對加速M1重編程為M2狀態產生積極作用，進而誘導血管生成和再上皮化，導致糖尿病創面區域的皮膚愈合(圖7A)。

圖7. 水凝膠中的生物活性分子可以改善免疫功能紊亂，促進傷口愈合

雖然，基于免疫調節策略的水凝膠是治療糖尿病足潰瘍最有效的途徑之一。然而，它們在調節糖尿病傷口慢性炎癥和受損新生血管方面的治療效果有限。另一方面，細菌感染更被懷疑在高血糖微環境中導致過多的ROS生成，這可能通過阻礙血管生成和加重炎癥反應而阻礙傷口愈合過程。因此，迫切需要設計一種多功能水凝膠，既能高效調節炎癥反應，又能同時摧毀創面區域的細菌和ROS，從而誘導新生血管形成，促進創面愈合。在下一節中，作者將討論水凝膠免疫療法與多種新興的ROS清除和細菌消除方法相結合的最新研究。2021年，Tu等人報道了一種M2型巨噬細胞極化的抗炎、抗氧化和抗菌水凝膠(GDFE)，用于誘導血管生成和促進糖尿病傷口愈合。通過f127 ε-聚賴氨酸(FE)與聚多巴胺修飾的氧化石墨烯(GO)發生希夫堿反應制備GDFE水凝膠(圖8A)。

圖8. GDFE水凝膠合成促進糖尿病傷口愈合的原理圖

DFUs治療中的免疫調節新趨勢

近年來，光熱療法(PTT)作為一種可克服耐藥并發癥的替代抗生素療法備受關注。PTT是一種非侵入性的策略，可以通過將近紅外(NIR)光轉化為熱來消除廣泛的細菌。另一方面，有報道約40-41℃的輕度熱刺激可誘導血管生成，也可減少對傷口愈合過程至關重要的炎癥。在這方面，Yuan等引入了一種M2巨噬細胞極化的抗炎抗菌抗氧化水凝膠聯合溫和光熱療法和促血管生成藥物[去鐵胺(DFO)]治療DFUs。對于水凝膠的制備，首先，介孔PDA np (MPDA np)與DFO形成亞胺鍵(M@D)。然后，將表沒食子兒茶素沒食子酸酯二聚體接枝的透明質酸(HA-EGCG)和酪胺接枝的類人膠原(HLC-TA)酶聯并整合M@D，制備HTHE-M@D水凝膠(圖9A)。

圖9. HTHE-M@D水凝膠的合成以及水凝膠和輕度熱刺激聯合作用下糖尿病足創面愈合的機理示意圖

糖尿病大鼠足部創面模型顯示HTHE-M@D + L組創面愈合速度最快，第13天幾乎完全愈合。在另一項研究中，Guo等人利用甲基丙烯酸化明膠(GelMA)和氧化葡聚糖(oDex)，并在其上裝載黑磷(BP)納米片和氧化鋅納米顆粒(ZnO NPs)。凝膠/BP/ZnO +近紅外水凝膠顯示出優異的體內外抗菌性能，這是由于BP在808 nm近紅外激光照射下的光熱活性和ZnO釋放增加了巨噬細胞對細菌的吞噬。凝膠/BP/ZnO +近紅外水凝膠的體外細菌存活率低于5%，而無近紅外照射的水凝膠為20%。綜上所述，凝膠/BP/ZnO +近紅外水凝膠能夠促進細菌感染創面愈合，愈合速度最快(64%)，這是由于ZnO的免疫調節作用結合輕度熱刺激，可以消除炎癥和誘導血管生成，從而縮短細菌感染創面愈合時間。為了進一步通過光熱療法提高廣譜細菌的抗菌殺滅效果，Liu等人提供了一種聚(n -丙烯酰甘氨酰胺)(PNAGA)聚合物，該聚合物與經PDA涂層的金納米棒(Au@PDA NRs)混合，并被E.coli或金黃色葡萄球菌活化的巨噬細胞膜(稱為E/SMM-PNAGAAu@PDA水凝膠)包裹，由于巨噬細胞膜上表達特定的細菌受體，該聚合物可以靶向特定的細菌(圖10A)。近紅外照射會破壞水凝膠微環境中積累的細菌。水凝膠在近紅外照射下對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的殺滅率分別為98.4%和97.6%(圖10B)。這一特征有助于光熱療法的血管生成誘導作用，以促進糖尿病傷口愈合。

圖10. 具有細菌特異性識別能力的MM-PNAGA-Au@PDA水凝膠設計示意圖

【小結】

本文基于不同免疫調節水凝膠的應用，總結了加速糖尿病傷口愈合的先進策略。首先，討論DFUs的病理特征及相關的免疫調節策略。其次，本文綜述了功能性水凝膠用于DFUs免疫調節的最新研究進展，并討論了最近發展的基于功能性水凝膠的DFUs免疫調節治療模式。最后，討論了具有臨床轉化潛力的先進傷口愈合技術和新興的基于水凝膠的免疫調節方向。